植物原生質(zhì)體制備及轉(zhuǎn)化試劑盒
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貨號
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名稱
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包裝
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RTU4052
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植物原生質(zhì)體制備及轉(zhuǎn)化試劑盒
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5 ml×40次
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● 產(chǎn)品組成：
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組分貨號
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名稱
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規(guī)格
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貯存
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運輸
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RTU4052-01
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溶液I-酶溶解溶液（2×）
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100 ml
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-20℃
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RT
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RTU4052-02
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溶液II-漂洗溶液
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200 ml
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-20℃
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RT
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RTU4052-03
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溶液III-重懸溶液
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25 ml
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-20℃
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RT
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RTU4052-04
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組份IV-轉(zhuǎn)化試劑
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5 ml
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-20℃
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RT
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RTU4052-05
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溶液V-培養(yǎng)溶液
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25 ml
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-20℃
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RT
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BME
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還原劑
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1 ml
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RT
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RT
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BSA-02
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50mg/ml BSA溶液
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5 ml
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-20℃
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RT
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說明書
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一份
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● 產(chǎn)品簡介：
植物原生質(zhì)體是指脫去全部細(xì)胞壁由質(zhì)膜包被的具有生命活力的裸露細(xì)胞。它具有細(xì)胞生命特征和全能型，是細(xì)胞無性系變異和突變體篩選的重要來源，同時也是植物遺傳工程的理想受體和遺傳改良的理想材料。酶解法分離原生質(zhì)體是一個常用的技術(shù)，其原理是植物細(xì)胞壁主要由纖維素、半纖維素和果膠質(zhì)組成，因而使用纖維素酶、半纖維素酶、離析酶和果膠酶能降解細(xì)胞壁成分，去除細(xì)胞壁，即可得到原生質(zhì)體。許多方法可誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合，現(xiàn)在被廣泛采用的融合方法是聚乙二醇（PEG）法。聚乙二醇（PEG）作為一種高分子化合物，合適的濃度能對原生質(zhì)體產(chǎn)生瞬間沖擊效應(yīng)，原生質(zhì)體很快發(fā)生收縮與粘連，隨后用高鈣高pH法進(jìn)行清洗，使原生質(zhì)體融合得以完成。
按照每次使用5
ml酶消化體系計算，本試劑盒可用于40次酶消化反應(yīng)。本試劑盒每個5 ml反應(yīng)體系可處理0.1 g左右的擬南芥葉片(約10~15葉片)，操作較好的情況下每5 ml體系可獲得約50-70萬個原生質(zhì)體(不同植物不同操作會有一定的差異)，可滿足約25-70個樣品的原生質(zhì)體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染操作(按照每樣1-2萬個細(xì)胞計算)。
原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化時，本試劑盒可以用于相當(dāng)于6孔板40個孔的樣品，12孔板80個孔的樣品，或24孔板160個孔的樣品的轉(zhuǎn)化。
● 貯存和效期：
-20°C保存，至少一年有效。
組分I，II，III，V 4℃存放3-5天不會影響使用效果，長期不用，按照標(biāo)簽-20℃貯存。
試劑盒常溫運輸。
● 使用說明：
需要準(zhǔn)備的材料（試劑盒不提供）：
剪尖吸頭（剪尖后可以用酒精燈過火將吸頭處理平滑）；纖維素酶R-10；離析酶R-10；平頭鑷子；70μm細(xì)胞過濾篩；一次性刀片；50ml離心管；1.5ml離心管；水浴鍋。
一、原生質(zhì)體分離：
即用型酶溶液配制
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5 ml配制量
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10 ml 配制量
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溶液I（2×）
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2.5
ml
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5
ml
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纖維素酶R-10
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0.075克
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0.15 克
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離析酶R-10
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0.02 克
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0.04 克
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混勻后 55℃水浴 10 min，期間顛倒混勻 2-3次，冷卻至常溫后加入以下成分。
注：55oC孵育可以有效滅活DNase和Protease，并促進(jìn)酶溶解
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還原劑
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2.5
μl
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5
μl
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50mg/ml
BSA
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0.1
ml
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0.2
ml
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滅菌水
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定容至5 ml
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定容至10 ml
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注：即用型酶溶液現(xiàn)用現(xiàn)配，不建議配制后凍存后再使用；
溶解好的正常酶溶液應(yīng)為澄清棕黃色溶液，如使用純度不好的酶，溶液為不溶解的乳白色懸濁液，不能使用。
1. 酶解：
取生長狀態(tài)良好的葉片切成0.5-1 mm的小條，按照0.1
克葉片（擬南芥約15-20個葉片）加5
ml即用型酶溶液的比例迅速將切割好的葉片小條浸泡于酶溶液中，避光，無需震蕩，常溫（20-25℃）酶解3小時，間歇混勻。
注：酶解時間與葉片種類，葉片生長狀態(tài)有關(guān)，請根據(jù)實驗需要適當(dāng)調(diào)整酶解時間。3小時為擬南芥葉片推薦的酶解時間。如條件允許，可以使用微型真空泵常溫避光條件下抽真空30 min，以使酶溶液更好地進(jìn)入細(xì)胞間隙。酶溶液變?yōu)榫G色表明有原生質(zhì)體已經(jīng)有分離，溶液為濃綠色表明原生質(zhì)體已經(jīng)大量分離。擬南芥原生質(zhì)體大小約為30-50 μm，顯微鏡鏡檢后確定是否分離。葉片原生質(zhì)體細(xì)胞顯微鏡下為綠色圓球狀，葉綠體分散在整個細(xì)胞內(nèi)，說明狀態(tài)較好；如呈現(xiàn)不規(guī)則形狀，說明原生質(zhì)體破碎或即將破碎。
2. 漂洗：
酶解后加入等體積的溶液II，如使用5 ml酶解體系，加入5 ml溶液II，輕柔混勻。
3. 過濾：
用孔徑70 μm篩網(wǎng)過濾步驟2中的溶液，去除未消化的葉片，收集濾出液于50 ml離心管中。
4. 第一次收集：
濾出液100g常溫離心 2分鐘，盡量去除上清。
注：為了避免原生質(zhì)體離心時貼在管壁，建議整個實驗過程使用水平轉(zhuǎn)頭；離心時，可調(diào)低離心機的升速和降速。升速過快，原生質(zhì)體可能離到管壁上；降速過快，可能導(dǎo)致管底原生質(zhì)體懸起。
5. 第二次收集：
加入2-5 ml 溶液II，用剪尖的藍(lán)吸頭重懸原生質(zhì)體，冰浴30分鐘，原生質(zhì)體在重力作用下可以沉降到離心管底部，盡量吸除上清，收集原生質(zhì)體。(如果發(fā)現(xiàn)原生質(zhì)體沉降的速度比較慢或者得率比較低，也可以考慮常溫100 g離心1-2 min收集原生質(zhì)體)。
6. 重懸：
小心去除上清溶液，不要觸動原生質(zhì)體沉淀，沉淀用剪尖的藍(lán)吸頭重懸于1 ml溶液III中即為原生質(zhì)體溶液。（可以用血球計數(shù)板計數(shù)，根據(jù)原生質(zhì)體數(shù)量調(diào)整溶液III的加入體積，使得原生質(zhì)體密度為2×105/ml或更高）。
注：制備好的原生質(zhì)體可以在4°C或冰浴保存至少24 h。
二、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和培養(yǎng)：
1. 轉(zhuǎn)化溶液配制：
植物原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化參考下表根據(jù)樣品量配制轉(zhuǎn)化溶液。
轉(zhuǎn)化溶液現(xiàn)用現(xiàn)配。轉(zhuǎn)化溶液需要在轉(zhuǎn)化前至少1小時配制，以確保轉(zhuǎn)化試劑溶解充分。轉(zhuǎn)化溶液配制后盡量當(dāng)天使用。配制好的轉(zhuǎn)化溶液4℃保存3-5天之內(nèi)仍然有較好的轉(zhuǎn)化效率，但和當(dāng)天配制的轉(zhuǎn)化溶液相比，轉(zhuǎn)化效果可能會有一定程度的下降。
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120 μl
（1個樣品）
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1.2 ml
（10個樣品）
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5 ml
(約40個樣品)
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轉(zhuǎn)化試劑粉末
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48
mg
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480
mg
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2
g
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轉(zhuǎn)化試劑溶解液（2×）
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60
μl
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0.6
ml
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2.5
ml
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滅菌水
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定容至120 μl
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定容至1.2 ml
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定容至5 ml
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2. 準(zhǔn)備質(zhì)粒：
取10 μl質(zhì)粒DNA(10-20
μg，濃度為1-2 μg/μl)于1.5 ml 離心管中。
注：質(zhì)粒大小建議為5-10
kb，質(zhì)粒濃度為1-2 μg/μl左右；
原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化對于質(zhì)粒的純度要求較高，盡量使用高純度的質(zhì)粒。
3. 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化：
3.1 質(zhì)粒管中加入100 μl原生質(zhì)體溶液（原生質(zhì)體密度為2×105/ml，約2萬個原生質(zhì)體），輕柔混勻。
3.2 加入等體積即110 μl 步驟1事先準(zhǔn)備好的轉(zhuǎn)化溶液，輕彈管底，輕柔混勻，常溫25℃放置5-15分鐘。
注：最長可以孵育15 min，但通常孵育5min時間已經(jīng)足夠。最佳的孵育時間對于不同的原生質(zhì)體和不同的質(zhì)粒需要通過實驗摸索。
4. 終止轉(zhuǎn)化：
加入2倍體積即440 μl 溶液II，輕柔徹底混勻，終止轉(zhuǎn)化過程。
5. 收集原生質(zhì)體：
常溫100g離心1-2分鐘，盡量去除上清。
注：由于轉(zhuǎn)化后的溶液會非常粘稠，加入溶液II后離心1
min通?？梢允乖|(zhì)體聚集在管底，但使用某些突變體時為減少原生質(zhì)體損失，可將離心時間延長到2 min。
6. 原生質(zhì)體漂洗：
加入500 μl溶液II輕輕重懸原生質(zhì)體，常溫100g離心1 min，盡量去除殘留的上清。注：本步驟可以充分去除殘留的轉(zhuǎn)染試劑溶液中的組分，避免轉(zhuǎn)染試劑溶液中的組分對于后續(xù)的不良影響。
7. 原生質(zhì)體重懸：
沉淀中加入1
ml溶液V，輕柔重懸。
8. 原生質(zhì)體培養(yǎng)：
將離心管水平放置，23-25oC弱光培養(yǎng)。
注：根據(jù)實驗需求確定孵育時間。RNA分析孵育2-6小時；酶活性分析和蛋白標(biāo)記實驗孵育2-16小時；基因編輯的效果在轉(zhuǎn)染24小時后可能被檢測到。
三、實驗示例：
使用原生質(zhì)體植物原生質(zhì)體制備及轉(zhuǎn)化試劑盒轉(zhuǎn)染擬南芥原生質(zhì)體的效果圖。
實驗步驟：稱取0.48
g轉(zhuǎn)化試劑于2 ml 離心管中，加入轉(zhuǎn)化試劑溶解液后，顛倒混勻，蒸餾水定容至2 ml，使轉(zhuǎn)化試劑充分溶解后備用。在2 ml的圓底離心管中加入10 μl（20 μg）EGFP質(zhì)粒
(植物用綠色熒光蛋白)，加入100 μl制備好的原生質(zhì)體，輕柔混勻后加入110 μl當(dāng)日配制好的轉(zhuǎn)化試劑溶液，輕柔混勻，常溫靜置5
min后加入440 μl溶液II終止轉(zhuǎn)化，輕輕顛倒混勻，常溫100 g離心1 min，去除上清，再加入0.5 ml溶液II，輕柔重懸原生質(zhì)體，常溫100 g離心1 min后，盡量去除上清，收集原生質(zhì)體。加入1 ml溶液V，小心重懸原生質(zhì)體后水平放置25℃培養(yǎng)過夜(約16h)，次日于熒光顯微鏡下檢測EGFP熒光信號。
植物原生質(zhì)體提取試劑盒發(fā)表文章列表（21篇）
1. [IF=3.19] TaEXPB7-B,a -expansin
gene involved in low-temperature stress and abscisic acid responses,
promotes growth and cold resistance in Arabidopsis
thaliana.
實驗植物：小麥
Author: Xu Feng, Yongqing Xu, Lina Peng,
Xingyu Yu, Qiaoqin Zhao, Shanshan Feng, Ziyi Zhao, Fenglan Li, Baozhong
Hu.
Journal: J Plant Physiology 2019
Institution： College
of Life Sciences, Northeast Agricultural University
Paper link：http://www.plantphysiol.org/content/174/4/2487
2. [IF=5.36] Involvement of the
chloroplast gene ferredoxin 1 in multiple responses of Nicotiana benthamiana to
Potato virus X infection.
實驗植物：煙草
Author: Xue Yang, Yuwen Lu, Fang Wang,
Ying Chen, Yanzhen Tian, Liangliang Jiang, Jiejun Peng, Hongying Zheng,
Lin Lin, Chengqi Yan, Michael Taliansky, Stuart MacFarlane, Yuanhua Wu,
Jianping Chen and Fei Yan
Journal: Journal of Experimental
Botany, 2020，Vol.71,
No. 6,2142–2156,
Institution：Institute
of Plant Virology, Ningbo University
Paper link：https://academic.oup.com/jxb/article/71/6/2142/5686178?login=true
3. [IF=7.228] Turnip mosaic
virus impairs perinuclear chloroplast clustering to facilitate viral infection
實驗植物：煙草
Author:Yushan Zhai, Quan Yuan, Shiyou Qiu,
Saisai Li, Miaomiao Li, Hongying Zheng, Guanwei Wu, Yuwen Lu, Jiejun Peng,
Shaofei Rao, Jianping Chen, Fei Yan
Journal: Plant Cell Enviroment, 2021，30
July
Institution：Institute
of Plant Virology, Ningbo University
Paper link：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pce.14157
4. [IF=5.64] A Novel, Small
Cysteine-Rich Effector, RsSCR10 in Rhizoctonia solani Is Sufficient to Trigger
Plant Cell Death
實驗植物：水稻
Author:Xianyu Niu, Guijing Yang, Hui Lin, Yao
Liu, Ping Li and Aiping Zheng
Journal: Fronties in Microbiology August
2021 | Volume 12 | Article 684923
Institution：Sichuan
Agricultural University
Paper link：https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2021.684923/full
5. [IF=9.8] Synthesis of
flavour-related linalool is regulated by PpbHLH1 and associated with changes in
DNA methylation during peach fruit ripening
實驗植物：煙草
Author: Chunyan Wei, Hongru Liu,
Xiangmei Cao, Minglei Zhang, Xian Li, Kunsong Chen and Bo Zhang
Journal: Plant Biotechnology Journal (2021)
19, pp. 2082–2096
Institution：Laboratory
of Fruit Quality Biology/Zhejiang Provincial Key Laboratory of Horticultural
Plant Integrative Biology, Zhejiang University
Paper link：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.13638
6. [2020IF=1.04] EoPHR2, a
Phosphate Starvation Response Transcription Factor, Is Involved in Improving
Low-Phosphorus Stress Resistance in Eremochloa ophiuroides
實驗植物：擬南芥
Author: Ying Chen1,#, Chuanqiang Liu1,#,
Qingqing He1, Jianjian Li2, Jingjing Wang2, Ling Li2, Xiang Yao2, Shenghao
Zhou3, Haoran Wang
Journal: Phyton Vol.91, No.3,
2022, pp.651-665
Institution： Institute
of Botany, Jiangsu Province and Chinese Academy of Sciences
Paper link：https://www.techscience.com/phyton/v91n3/45309
7. [2021IF=3.2] Establishment
and optimization of PEG-mediated protoplast transformation in the microalga Haematococcus
pluvia
實驗材料：雨生紅球藻 Haematococcus
pluvia
Author: Chunli Guo，Muhammad
Anwar， Rui Mei，Xinyi
Li， Di Zhao，Yanan
Jiang， Jieyi
Zhuang， Chen Liu，Chaogang
Wang， Zhangli Hu
Journal: Journal of Applied Phycology. Published
online 07 March 2022
Institution：College
of Optoelectronic Engineering, Shenzhen University
Paper link： https://link.springer.com/article/10.1007/s10811-022-02718-x
8. [2021 IF=5.9] The Genome-Wide
Identification of Long Non-Coding RNAs Involved in Floral Thermogenesis in
Nelumbo nucifera Gaertn
實驗材料：睡蓮 Nelumbo nucifera Gaertn
Author: Jing Jin , Yu Zou, Ying Wang,
Yueyang Sun, Jing Peng and Yi Ding
Journal: Int. J. Mol. Sci. 2022, 23, 4901.
Institution：College
of Life Sciences, Guizhou University，College
of Life Sciences, Wuhan University
Paper link： https://www.mdpi.com/1422-0067/23/9/4901
9. [2021 IF=17.9] Genome-wide association
analysis reveals a novel pathway mediated by a dual-TIR
domainprotein for pathogen resistance in cotton
實驗材料：棉花
Author: Yihao Zhang, Yaning Zhang,
Xiaoyang Ge, Yuan Yuan, Yuying Jin, Ye Wang, Lihong Zhao, Xiao Han, Wei Hu, Lan
Yang, Chenxu Gao, Xi Wei, Fuguang Li, Zhaoen Yang
Journal: Genome Biology (2023) 24:111
Institution：Institute
of Cotton Research, Chinese Academy of Agricultura Sciences
Paper link： https://doi.org/10.1186/s13059-023-02950-9
10. [2022
IF=7.4] Rose long noncoding RNA lncWD83 promotes flowerin by modulating
ubiquitination of the floral repressor RcMYC2L
實驗材料：Rose 玫瑰
Author: Chen
Yeqing ,Lu Jun ,Wang Weinan ,Fan Chunguo
,Yuan Guozhen ,Sun Jingjing ,Liu Jinyi ,Wang Changquan
Journal: Plant Physiol (2023) Published: 19 September 2023
Institution：College
of Horticulture, Nanjing Agricultural University
Paper link： https://doi.org/10.1093/plphys/kiad502
11. [2022
IF=17.4] Functionalized carbon nano-enabled plant ROS signal engineering for
growth / defense balance
實驗材料：擬南芥
Author: Zhijiang
Guo , Qiong Chen , Taibo Liang , Baoyuan Zhou , Suhua Huang , Xiufeng Cao,
Xiuli Wang , Zaisong Ding, Jiangping Tu
Journal: Nano Today 53 (2023) 102045
Institution：School
of Materials Science and Engineering, Zhejiang University
Paper link：https://doi.org/10.1016/j.nantod.2023.102045
12. [2022
IF=13.8] Unveiling the mechanism of broad-spectrum blast resistance in rice:
The collaborative role of transcription factor OsGRAS30 and histone deacetylase
OsHDAC1
實驗材料：水稻
Author: Jiaqi
Hou, Huangzhuo Xiao, Peng Yao, Xiaoci Ma, Qipeng Shi, Jin Yang, Haoli Hou and
Lijia Li
Journal: Plant Biotechnology Journal (2024), pp. 1–17
Institution：State
Key Laboratory of Hybrid Rice, College of Life Sciences, Wuhan University
Paper link：https://doi.org/10.1111/pbi.14299
13. [2022
IF=7.2] NnSnRK1-NnATG1-mediated autophagic cell death governs flower bud
abortion in shaded lotus
實驗材料：荷花
Author: Xiehongsheng
Li, Yingchun Xu, Zongyao Wei, Jiaying Kuang, Mingzhao She, Yanjie Wang and
Qijiang Jin
Journal: Plant J (2024) 117, 979–998
Institution：College of Horticulture, Nanjing Agricultural University
Paper link： https://doi.org/10.1111/tpj.16655
14. [2022
IF=7.5] The dynamic TaRACK1B-TaSGT1-TaHSP90 complex modulates
NLR-protein-mediated antiviral immunity in wheat.
實驗材料：小麥
Author: Haichao
Hu, Tianye Zhang, Jinnan Wang, Jun Guo, Yaoyao Jiang, Qiansheng Liao, Lu Chen,
Qisen Lu,Peng Liu, Kaili Zhong, Jiaqian Liu, Jianping Chen, Jian Yang
Journal: Cell Reports 43, 114765, October 22,
2024
Institution：Institute of Plant Virology, Ningbo University
Paper link： https://doi.org/10.1016/j.celrep.2024.114765
15. [2023
IF=14.3] Natural SNP Variation in GbOSM1 Promotor Enhances Verticillium Wilt
Resistance in Cotton.
實驗材料：棉花
Author: Guilin
Wang, Dayong Zhang, Haitang Wang, Jinmin Kong, Zhiguo Chen, Chaofeng Ruan, Chaoyang
Deng, Qihang Zheng, Zhan Guo, Hanqiao Liu, Weixi Li, Xinyu Wang, Wangzhen Guo
Journal: Advanced Science 2024, 2406522
Institution：Nanjing Agricultural University
Paper link：https://doi.org/10.1002/advs.202406522
16. [2023
IF=14.7] Re-localization of a repeat-containing fungal effector by apoplastic
protein Chitinase-like 1 blocks its toxicity.
實驗材料：擬南芥
Author: Hanqiao
Liu, Wenshu Zhang, QinqfeiHe, Reyila Aikemu,HuijuanXu, Zhan Guo, LuWang, WeixiLi,
GuilinWang, XinyuWang , Wangzhen Guo
Journal: Nature Communications (2024)15:10122
Institution：Nanjing Agricultural University
Paper link：https://doi.org/10.1038/s41467-024-54470-0
17. [2023
IF=14.7] Rational design of phytovirucide inhibiting nucleocapsid protein aggregation
in tomato spotted wilt virus.
實驗材料：煙草
Author: Ningning
Zan ,JiaoLi ,JiahuiYao , ShangWu ,JianzhuanLi , Feifei Chen,Baoan Song, Runjiang
Song
Journal: Nature Communications 2025，16:2034
Institution：Guizhou University
Paper link：https://doi.org/10.1038/s41467-025-57281-z
18. [2023
IF=4.8] lncRNA- Encoded Small Peptide Promotes Viral Infection.
實驗材料：煙草
Author: Yaoyao Li,
Juan Zhang,Chunyan Qi,Qitao Mo,Kaili Zhong,Jiaqian Liu,Hailin Cai,Jianyong Li,Jianping Chen,Jian Yang,Peng Liu
Journal: Molecular Plant Pathology 2025;
26:e70084
Institution：Ningbo University
Paper link：https://doi.org/10.1111/mpp.70084
19. [2023
IF=6.5] OsHDAC1 deacetylates the aldehyde dehydrogenase OsALDH2B1, repressing OsGR3
and decreasing salt tolerance in rice
實驗材料：水稻
Author: Yequn
Wu, Jiaqi Hou, Huangzhuo Xiao, Shiqi Ye, Daoyi Tu, Ronghua Qiu, Xiaoci Ma,
Yating Zhao, Tingyu Chen and Lijia Li
Journal: Plant Physiology, kiaf149，Published: 11
April 2025
Institution：Wuhan University
Paper link： https://doi.org/10.1093/plphys/kiaf149
20. [2023
IF=14.7] An m6A methyltransferase confers host resistance by
degrading viral proteins through ubiquitination.
實驗材料：小麥
Author: Jun
Guo, Tianye Zhang, Haoxin Xie, Haichao Hu, Chaonan Shi, Yingjie Zhao,Jingliang
Yin, Gecheng Xu, Zechi Wu, Pengkun Wang, Jiaqian Liu, Peng Liu,Kaili Zhong,
Feng Chen, Jianping Chen，Jian
Yang
Journal: Nature
Communications ，(2025)
16:4821
Institution：Ningbo University
Paper link： https://doi.org/10.1038/s41467-025-60199-1
21.
[2023 IF=4.8] Bioremediation potential of lowbrominated polybrominated diphenyl by the
phyllospheric Wickerhamomyces anomalus.
實驗材料：煙草
Author: JMan Cai, Zheng Xing, Xiaolei Yuan,
Zhangyu Song,Xiaojing Wang，Kejiu Du
Journal: Frontiers in Plant Science Published 11 July 2025
Institution：College of
Forestry, Hebei Agricultural University
Paper link： https://doi.org/10.3389/fpls.2025.1606962